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RNA干扰 | 药物靶标确认的利器
发布时间:2024-09-14

RNA干扰(RNAi)是有效沉默或抑制目标基因表达的过程,指利用内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解,从而导致靶基因的表达沉默,产生相应的功能表型缺失。RNA干扰作为一种新型且强大的基因沉默工具,广泛应用于生物学和治疗学研究,特别是针对癌症或其他疾病治疗中的无成药性靶标。


RNA干扰的发现历程

• 1984年,反义RNA被发现能够抑制基因的表达,且双链RNA比单链RNA效果更佳。

• 1990年,Jorgensen研究小组在研究时,推测外源查尔酮合成酶基因抑制了内源基因表达。

• 1992年,Romano和Macino在粗糙链孢霉中观察到类似现象。

• 1995年,Guo和Kemphues在线虫中也观察到了RNA干扰现象。

• 1998年,Andrew Z. Fire等在秀丽隐杆线虫(C.elegans)实验中揭示双链RNA的抑制效果强于正义或反义RNA,推测存在扩增效应和酶活性参与,并命名为RNA干扰。

 

RNA干扰家族成员

RNA干扰由转运到细胞质中的双链RNA激活,表现为小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)诱导实现靶mRNA降解的基因沉默;小RNA(miRNA)诱导特定mRNA翻译的抑制;短反义核酸(siRNA和shRNA序列)对锁定细胞的mRNA进行降解阻断了该蛋白的进一步表达/聚集,导致其水平的下降,最终实现抑制作用。

siRNA VS miRNA



RNA干扰的技术要点

siRNA设计

• 严格配对:siRNA反义链与靶基因需严格碱基配对,避免单碱基错配。

• 特异性:设计siRNA时,确保其与靶基因高度同源,减少与其他基因同源性。

• 序列选择:

1. 从AUG下游找AA双核苷酸,及其后19个核苷酸作为模板。

2. 每个基因选4-5个序列,通过生物信息学筛选特异性最强的。

3. 避开5'和3'非翻译区及起始密码子附近,减少调节蛋白竞争。

 

siRNA合成    

体外制备

• 化学合成:适用于已知有效序列,成本高,周期长。

• 体外转录:成本较低,速度快,毒性小,稳定性好,效率高。

• RNase III消化:快速经济,用于研究基因功能缺失,可能引发非特异沉默。


体内表达    

1. siRNA表达载体    

多数siRNA表达载体采用RNA聚合酶III(pol III)启动子,如人/鼠U6和人H1,这些启动子擅长在哺乳动物细胞中表达小分子RNA,并以一串(3-6个)U终止转录。构建时需订购两段编码shRNA的DNA单链,退火后克隆至载体pol III启动子下游,过程耗时数周至数月,需测序验证。该载体优点在于长期研究潜力,带抗生素标记的可持续抑制靶基因数周至更久。病毒载体则高效感染细胞,提升转染稳定性和效率,适合基因沉默研究。

最适用于:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默。

不适用于:筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作)。


2. siRNA表达框架    

siRNA表达框架(SECs)为PCR产物,集成了RNA pol III启动子、发夹结构siRNA及终止位点,无需载体克隆即可直接导入细胞表达。相比传统载体,SECs省去了克隆、测序等耗时步骤,快速高效,是筛选siRNA及优化启动子-siRNA组合的理想工具。若PCR设计时加入酶切位点,筛选出的高效siRNA可便捷克隆至载体,构建稳定表达载体,用于长期抑制研究。这个方法的主要缺点是:

(1)PCR产物很难转染到细胞中;

(2)不能进行序列测定,PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。

最适用于:筛选siRNA序列,在克隆到载体前筛选最佳启动子。

不适用于:长期抑制研究(如果克隆到载体后就可以了)。

 

RNA干扰(RNAi)技术的应用

RNAi因其在基因沉默上的高效与简便性,成为基因功能研究的利器。它模拟药物抑制标靶基因(疾病基因)的机制,采用功能丢失(LOF)策略优于传统功能获得(GOF)法,故在制药业中尤为关键,用于药物靶标验证。有效的siRNA/shRNA不仅助力靶标识别,更可潜力转化为RNAi药物。

RNAi技术在药物靶标发现与验证中广泛应用,企业常利用RNAi文库筛选细胞,通过表型变化识别功能基因,如抑制肿瘤生长的基因。若靶标具备成药潜力(如膜蛋白或分泌蛋白),则进一步开展大规模药物筛选。同时,RNAi技术也用于细胞及动物模型中对靶标的二次验证。

临床应用中,双链小分子RNA/siRNA已试用于多种疾病治疗,如老年黄斑变性、ALS、类风湿性关节炎及肥胖等。在抗病毒及神经系统疾病(如帕金森病)的治疗探索中,RNAi疗法初显成效,肿瘤治疗领域亦取得进展。

 

豪利777生物

RNAi设计与合成

豪利777生物提供高度定制化的siRNA和miRNA合成服务,通过精湛工艺和严格质检确保产品优质。我们提供多样化、经化学修饰的siRNA,如磷酸、核糖和碱基修饰,以增强其体内稳定性和效果。同时,我们也供应多种miRNA产品,包括模拟物、抑制剂和对照品,以满足不同研究需求。

 

 

参考文献

DOI: 10.1631/jzus.B1700594.

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